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我所基因编辑研究团队在植物广泛识别非典型PAM序列的SpCas9变体编辑工具盒研究方面取得新进展

发布日期:2021-01-04   作者:李娟    来源:水稻所    阅读:
   近日,我所基因编辑研究团队在国际知名学术期刊Molecular Plant上发表了题为Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical protospacer-adjacent motif compatibility in plants的研究论文。该研究开发了5SpCas9变体介导的基因组编辑工具和新型碱基编辑器,极大拓展了SpCas9在植物基因组中的基因编辑范围,为开发不受其固有靶向限制所束缚的编辑技术提供基础。

CRISPR-Cas来源于细菌获得性免疫防御系统。工程化改造后的CRISPR-Cas系统主要由Cas蛋白和sgRNA两部分组成,Cas蛋白在sgRNA的引导下识别特定的PAM (Proto-spacer adjacent motifs)序列并剪辑靶向序列,使DNA双链断裂,细胞内通过同源重组和非同源末端链接方式进行修复。来源于链球菌Streptococcus pyogenesCas9蛋白SpCas9最先被应用于基因编辑,也是应用最广泛的Cas蛋白。但SpCas9识别的PAM序列局限为经典的“NGG”,严重限制了基因组上可被编辑的位点。目前大部分的突变体如xCas9SpCas9-NGSpCas9-VQRSpCas9-VRER变体仍是依赖于含有GPAM序列,这些PAM扩展的编辑工具仍无法完全满足在实际应用过程中遇到的各种编辑情况,因此,具有广泛PAM相容性和强活性的新型SpCas9变体是植物基因组编辑的迫切需求。

20202月以来,5SpCas9变体,包括SpCas9-NRRHSpCas9-NRCHSpCas9-NRTHSpGSpRY,被相继开发并证明可以识别人类细胞中的非典型PAM结构。其中,SpCas9-NRRHSpCas9-NRTHSpCas9-NRCH可以识别人类细胞中的非GPAMNRNH,其中RAGHACT)。SpGSpRY能将编辑范围扩展到不依赖PAM

本研究在水稻密码子优化的SpCas9基础上引入系列关键氨基酸突变,获得了上述的5SpCas9变体。研究利用SpCas9-NRRHSpCas9-NRCHSpCas9-NRTH编辑了水稻基因组中138NRNH位点,结果表明这些变体在大部分位点都具有编辑效率;利用SpG变体及SpCas9-NG分别靶向水稻基因组32NGN位点, 表明SpGSpCas9-NGNGH 位点效率大部增强;利用SpRY变体可实现64NNN PAM中的大部分位点的效率,特别是SpCas9不能识别的非典型的PAM位点。随后这些SpCas9变体也分别与大鼠APOBEC1或人APOBEC3A的胞嘧啶编辑器和直接进化的高亲和性TADA*-8E脱氨酶的腺嘌呤碱基编辑器相结合,开发出可用于水稻基因组定点碱基替换的工具,在水稻基因组多个非典型PAM位点实现了C·G::T·A碱基间的定点替换。该研究在植物系统中有效扩展了SpCas9识别的PAM范围,大大扩展了靶向范围,为水稻基因功能解析和分子精准育种提供了有利工具。


 

原文链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1674205220304482