我所基因编辑团队在引导编辑效率提升方面取得新进展

精准高效的基因编辑技术在作物改良和植物基础研究中有着重要作用。尽管植物引导编辑(plant prime editing, PPE)技术极大地扩展了植物基因组精准编辑的范围和能力，但是目前编辑效率多数偏低，且在不同位点的效率差异较大。在哺乳动物细胞中，通过条件性敲低MLH1因子来抑制DNA错配修复（MMR）机制可以提高PE系统的效率，由于该策略在不同位点的性能不一致，导致其并未广泛用于植物PE的优化。

近日，水稻所基因编辑团队和安徽农业大学农学院魏鹏程课题组合作在Genome Biology（IF: 10.1）期刊上，在线发表了题为“Conditional knockdown of OsMLH1 to improve plant prime editing systems without disturbing fertility in rice”的最新研究成果。

本研究从筛选与引导编辑密切相关的DNA损伤修复因子出发，发现RNA干扰（RNAi）直接抑制水稻内源错配修复因子OsMLH1后，会明显提升水稻引导编辑效率。在ePE3系统的基础上，通过引入OsMLH1-ihpRNA表达模块实现OsMLH1的敲低，构建了引导编辑工具ePE5c。与已有的引导编辑工具ePE3相比，本任务开发的ePE5c将水稻愈伤组织中的平均引导编辑效率提高1.51倍，将稳转植株的平均编辑效率由71.5%提高至87.1%，特别是将纯合突变效率由23.9%提高至48.6%。但OsMLH1敲低后会引起水稻育性降低，影响引导编辑工具在种质改良的应用前景。

为解决这一难题，本研究设计了一个集成Cre-LoxP重组系统的ePE5c-Cre，使用干旱诱导的Rab17启动子驱动Cre表达，介导T-DNA 中两个 LoxP 位点之间的位点特异性 DNA 重组，从而切除OsMLH1-RNAi元件和Cre表达模块。此外，在第二个LoxP位点下游添加磷酸甘露糖异构酶（PMI）筛选标记基因，以便在切除发生后通过添加甘露糖富集重组事件。通过农杆菌介导的稳定水稻转化，对ePE5c-Cre系统进行位点编辑测试。结果表明，在Pid3-T和WRKY32-T位点，ePE5c-Cre系统的编辑效率分别为66.7%和100%，其中纯合体比例分别为19.05%和83.33%，且得到的T₀植株均恢复了正常的生殖能力。

本研究提出了一种通过瞬时抑制MMR机制优化PE效率的策略，不仅大幅提高了PE效率，也避免了长期抑制MMR导致基因组损伤的风险，该策略可广泛应用于不同植物物种的工程化高效PE系统。安徽农业大学农学院师资博士后刘小双、安徽省农科院水稻所基因编辑团队谷东方博士为论文共同第一作者，安徽农业大学魏鹏程教授和水稻所李娟研究员为共同通讯作者，本研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、安徽省科技重大专项等项目的资助。